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Propriedades de Uma Preparação Oral Contendo um Sal de Quitosana
 
O texto original se encontra em inglês. Os autores do mesmo não têm qualquer responsabilidade sobre os erros que esta tradução possa conter.
Comunicação
OPEN ACCESS molecules ISSN 1420-3049
www.mdpi.com/journal/molecules
Propriedades de Uma Preparação Oral Contendo um Sal de Quitosana
Yoshifumi Murata *, Youko Kodama, Daijirou Hirai, Kyouko Kofuji and Susumu Kawashima
Faculty of Pharmaceutical Science, Hokuriku University, Ho-3, Kanagawa-machi, Kanazawa 920-
1181, Japan; E-mails: 2007m006@stu.hokuriku-u.ac.jp (Y.K.), k-kofuji@hokuriku-u.ac.jp (K.K.)
*  Autor para quem a correspondência deve ser endereçada; E-mail: y-murata@hokuriku-u.ac.jp; Fone:
+81-076-229-6184; Fax: +81-076-229-2781.
Recebido: 18 de Novembro de 2008; na forma revisada: 11 de Fevereiro de 2009 / Aceito: 13 de Fevereiro de 2009 / Publicado: 13 de Fevereiro de 2009
Resumo:  O ácido 2-(4-clorofenoxi)-2-metilpropiônico (CMP) sal de quitosana (CS), CS-CMP, e de um derivado de CS (CP), foram preparados e sua habilidade para absorver ácidos biliares investigados. CS-CMP e CP-CMP absorveram rapidamente taurocolato (TCA) e glicocolato (GCA) quando estes ácidos biliares estiveram presentes juntos no meio, com liberação simultânea do CMP. Um ácido biliar secundário, taurodeoxycholate, foi preferencialmente absorvido sobre TCA e GCA. Gel de alginato contendo CS-CMP não diferiu do CS-CMP sozinho nas suas maneiras de prender ácidos biliares. Além disso, administração oral de CS-CMP a ratos resultou na diminuição dos níveis de colesterol sérico e triaciglicerol por duas semanas. Assim, CS-CMP, assim como um veículo contendo CS-CMP, pode ser um agente útil para tratar hiperlipidemia.
Palavras-chave: Quitosana, Ácido 2-(4-Clorofenoxi)-2-metilpropiônico; Absorção de ácido biliar; Liberação de drogas; Hiperlipidemia.
Introdução
Quitosana (CS) é um agente atraente para desenvolvimento de drogas dada sua função no trato gastrointestinal e sua segurança intrínseca quando tomada oralmente. CS é um polímero catiônico, e uma série de derivados de CS têm sido desenvolvidos e usados como resíduos de troca aniônica [1,2]. Recentemente, CS foi examinado como uma terapia alternativa, uma vez que a administração oral de CS leva à diminuição dos níveis séricos de colesterol [3-5]. Um mecanismo pela qual a CS pode diminuir os níveis de colesterol é pela absorção de ácidos biliares (BAs) [6]. BAs são secretados no trato gastrointestinal, principalmente como conjugados de glicina e taurina (BAs primários), depois disso, BAs secundários, tais como dexicolato são produzidos a partir dos BAs primários por microorganismos intestinais. BAs são através da circulação entero-hepática. Assim, a administração oral de uma resina trocadora de ânions, como a colestiramina, inibe a circulação entero-hepática dos BAs, diminuindo, assim, os níveis de colesterol sérico [7]. Além disso, um número de drogas capazes de influenciar o metabolismo lipídico têm sido utilizados no tratamento de hiperlipidemia [8-10]. Por exemplo, um ester etílico do ácido 2-(4-clorofenoxi)-2-metilpropiônico (CMP) transformado em CMP no intestino e o CMP é absorvido pelo trato intestinal.
Nós reportamos anteriormente que um sal ácido fraco de CS absorve ácidos biliares através de interações eletrostáticas [11,12]. Mesmo CMP sendo um ácido fraco com solubilidade em água limitada (0,85 mg/mL em 37°C), ele pode ser capaz de induzir a formação de um sal de CS. No presente estudo, nós preparamos um complexo eletrostático entre CS e CMP (um CMP sal de CS), chamado CS-CMP. Um derivado de CS, quitopal (CP), é utilizado como um veículo para imobilização de enzima. Nós também produzimos um CMP sal de um derivado CP, CP-CMP, e investigamos a absorção de BAs secretados no intestino humano por CS-CMP ou CP-CMP in vitro. Adicionalmente, CS-CMP foi introduzido na alimentação de ratos para investigar seu efeito nos níveis de colesterol sérico e triaciglicerol. Nós também desenvolvemos uma forma farmacêutica de CS-CMP, que pode ser engolido, porque CS é um pó fino e difícil de engolir. Assim, CS-CMP foi incorporado em esferas de gel de alginato induzidas por cálcio (Alg-Ca), e o potencial dessas esferas para reduzir a hiperlipidemia, seguindo administração oral, foi examinado in vitro [13].
Resultados e Discussão
Quando o taurocolato de sódio, TCA, e o glicocolato, GCA, (2mM cada) estiveram presentes no meio, eles foram rapidamente absorvidos pelo CS-CMP. Por exemplo, 0,19 ± 0,01 µmol/mg e 0,14 ± 0,04 µmol/mg de TCA e GCA foram absorvidos depois de 30 min, respectivamente. Ao mesmo tempo, CMP (0,24 ± 0,00 µmol/mg) foi liberado do pó. A mistura combinada de CS e CMP não absorveram BAs. Quatro compostos de CP-CMP preparados com CP2505, CP2605, CP3005 e CP3505 também foram testados. A extensão da absorção de BA foi afetada pelo número e/ou estrutura dos grupos aminoácidos em cada um dos compostos. A capacidade de absorção diminuia à medida que menos grupos de aminoácidos estivessem presentes, como mostrado na Figura 1. Além do CP2505, que continha sal de amônio quaternário, a absorção limitada de BAs foi observada com os compostos de CP sozinhos, na ausência de CMP. Estes resultados mostram que CS-CMP pode liberar CMP por troca iônica no interior do trato gastrointestinal quando o sal de CS é administrado oralmente. CP-CMP também pode absorver um ácido biliar secundário, taurodeoxicolato (TDCA). Em particular, CP-2505 e CP-2605 absorveram preferencialmente TDCA quando TCA (2 mM) e TDCA (2 mM) estiveram, ambos, presentes no meio. Quase duas vezes mais o TDCA do que o TCA foi absorvido.
A ingestão alimentar dos ratos não foi afetada pela adição de colesterol ou outros componentes à dieta em pó comercial (CRF-1). Nenhuma mudança na ingestão alimentar foi observada quando CS, CS-CMP, ou CMP foi adicionado à dieta HCH, e nenhuma diferença em efeitos no peso do corpo foi observada com as várias dietas. Entre os ratos alimentados com a dieta HCH, os níveis de colesterol sérico foram 97,9 ± 5,5 mg/dL (n=3) depois de 3 semanas. Os níveis de colesterol sérico mudaram quando compostos relacionados à quitosana foram adicionados à dieta HCH, como mostrado na figura 2. Em ratos alimentados com a dieta do CMP, a média de colesterol foi 78,8 ± 4,2 mg/dL em 3 semanas (n=3). Depois de 3 semanas, um decréscimo no colesterol sérico também foi observado no grupo da dieta CS. Um decréscimo pronunciado foi observado em ratos no grupo CS-CMP, com níveis de colesterol de 83,8 ± 9,9 mg/dL em 2 semanas e 67,5 ± 3,2 mg/dL em 3 semanas. Administração oral em ratos também resultou em decréscimo dos níveis de triaciglicerol. Como mostrado na Figura 3, triaciglicerol foi 2,8 ± 1,7 mg/dL em 3 semanas em ratos alimentados com a dieta CS-CMP, e quase cinco vezes esta quantidade em ratos alimentados com a dieta HCH. Este resultado pode ser devido à atividade farmacológica do CMP liberado no trato gastrointestinal. Na verdade, o mesmo efeito foi observado em 3 semanas em ratos alimentados com a dieta CMP (nível de triaciglicerol: 3,8 ± 2,6 mg/dL).

Figura 1. Absorção de BAs por CP-CMP.

Figura 1

Os resultados estão expressos como médias de valores e as barras indicam S.D. (n=3).

Figura 2. Mudanças no cholesterol sérico total.

Figura 2

Os resultados estão expressos como médias de valores e as barras indicam S.D. dos três experimentos. Diferenças significativas entre os dois grupos, * p<0,05.

Figura 3. Efeitos da dieta nos níveis de triaciglicerol sérico.

Figura 3

Os resultados estão expressos como médias de valores e as barras indicam S.D. dos três experimentos. Diferenças significativas entre os dois grupos, ** p<0,05.
O Alg-Ca preparado neste estudo, teoricamente, contém em torno de 100 mg de CS, que foi convertido em sal CMP dentro da matriz do gel, através de autoclave em suspensão CMP. Alg-ca pegou, gradualmente, dois tipos de Bas da solução, como mostrado na Figura 4. E a quantidade de CMP liberado do Alg-Ca aumentou gradualmente conforme os BAs eram pegos. Quando TCA e GCA estiveram ambos presentes no meio, igual captação pelo Alg-Ca foi observada. Entretanto, foi observada uma captação preferencial de glicoquenodeoxicolato, GDCA sobre TCA por Alg-Ca, quando ambos estiveram presentes na solução, com quase três vezes mais GDCA tomado depois de 60 min.

Figura 4. Captação de BAs em Alg-Ca seco contendo CS-CMP.

Figura 4

(A) Concentração inicial de BA; 2 mM TCA, 2 mM GCA
(B) Concentração inicial de BA; 2 mM TCA, 2 mM GCDA
Resultados estão expressos como médias, e as barras indicam S.D. (n=3).

Conclusões
Observou-se que CS-CMP, ou Alg-Ca contendo CS-CMP, como preparado neste estudo, demonstraram duas propriedades úteis no trato gastrointestinal: (a) eles liberam CMP, e (b) eles absorvem ácidos biliares. Além disso, a administração oral de CS-CMP a ratos diminuiu os níveis de triglicéride e colesterol sérico. CS-CMP, ou Alg-Ca contendo CS-CMP é agente potencial para o tratamanto de hiperlipidemia, e este último preparado neste estudo é um protótipo para dosagem em forma oral. Assim, faremos mais melhorias para a aplicação ao ser humano.
Experimental
Geral
Um tipo de CS (pó fino, peso molecular: 213,000 Da, grau de desacetilação: 75-85%) foi obtido da Kimitsu Chemical Industries (Tóquio, Japão), e quatro tipos de CP (chitopearl-BCW) foram obtidos da Fujibouseki Ltd. Co. (Tóquio, Japão). As estruturas destes são mostradas na Figura 5. Os diâmetros dos compostos de CP variavam entre 0,1 e 1,0 mm. CMP foi comprado da Aldrich Chem. Co. (Milwaukee, WI, USA). TCA, GCA, TCA e GDCA foram todos comprados da Nacalai Tesque (Quioto, Japão). Todos os outros produtos químicos foram de grau reagente.

Figura 5. Estruturas CP.

Figura 5

 

Preparação de CS-CMP
CS-CMP foi preparado como se segue: CS (10 g) e CMP (1 g) foram adicionados a agua (250 mL) e agitados por 1 dia a temperatura ambiente. A suspensão foi então filtrada com um filtro de vidro (17G), lavada duas vezes com etanol (100 mL) para remover qualquer CMP remanescente no resíduo. O pó obtido foi seco por 8 h em um prato, seguido pela dessecação em um vácuo na presença de P2O5.
Preparação de CP-CMP
Cada composto de CP foi comprado como uma resina de troca iônica (diâmetro; 0,5 mm). Ela foi lavada com água desmineralizada destilada e etanol utilizando a centrífuga, e então foi seca em temperatura ambiente. Os compostos de CP secos foram tratados com a suspensão de CMP como segue: CP (0,3 g) e CMP (0,03 g) foram adicionados a água (50 mL) e agitados por um dia em temperadura ambiente. A suspensão foi então centrifugada em 3.000 rpm por 5 min. O precipitado foi coletado e lavado duas vezes com água desmineralizada destilada e etanol (50 mL), seco em um prato, e dessecado sob um vácuo na presença de P2O5.
Preparação de Alg-Ca contendo CS-CMP
Alg-Ca contendo CS-CMP, Alg-CS, foi preparado como se segue: CS (0,5 g) foi disperso em 1(w/w)% de solução de alginato de sódio (9,5 g) com agitação. Dois gramas da suspensão contendo 5(w/w)% de CS foram abandonados em 0,1 M de CaCl2 (10 mL) usando uma pipeta de vidro, e deixados em repouso à temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, os grânulos esféricos de hidrogel (diâmetro; 4 mm) foram transferidos para água desmineralizada destilada (50 mL) contendo CMP (0,05 g), que foi autoclavado em 121 °C por 15 min. O Alg-Ca (grânulos de hidrogel) foi então retirado e secas a 35 °C por 8 h em um prato, seguido por um tratamento a vácuo em um dessecador na presença de P2O5.
Teste de Liberação de CMP e adsorção de ácido biliar
Quinze mililitros de solução de ácido biliar 2 mM foram colocados em tubos de vidro em forma de L e mantidos em 37 °C. Dez miligramas de CS-CMP ou Alg-CS seco, correspondentes a 2 g de hidrogel, foram adicionados aos tubos e agitados 67 vezes por min. Uma alíquota de 0,2 mL de cada solução foi removida periodicamente para determinar a quantidade de CMP e ácido biliar por análise por CLAE.  O sistema CLAE tinha uma bomba LC-6A (Shimadzu, Quioto, Japão), uma coluna empacotada (Mightysil RP-18 GP, 150 mm x 4,6 mm, Kanto Chem. Co., Tóquio, Japão), e um detector de UV SPD-6A (Shimadzu, Japão). A CLAE foi conduzida em temperatura ambiente, usando um eluente contendo methanol, 30 mM de tampão fosfato (pH 3,4), e acetonitrila (6:3:1), a uma vazão de 0,6 mL/min. O detector de comprimento de onda foi fixado em 230 nm. A quantidade de ácido biliar preso no Alg-CS foi calculado baseado na quantidade de ácido biliar adicionado e os restantes no tempo de amostragem. Todos os testes foram realizados em triplicata.
Estudo dos animais
O alimento em pó dado aos ratos na dieta foi certificada (CRF-1) e foi obtida da Oriental Yeast Co. (Japão). A composição da dieta, incluindo seu teor de colesterol (dieta HCH), é mostrado na Tabela 1.A dieta HCH contendo CS (dieta CS) ou CS-CMP (dieta CS-CMP) foi preparada pela adição de 4% de CS ou 4% de CS-CMP à dieta HCH. Cada dieta foi bem misturada e dada aos ratos após triagem através de uma peneira (710 µm).
Tabela 1: Composição da Dieta HCH.
Componente
(%)
CRF-1
96,8
Colesterol
1,0
Óleo de Oliva
2,0
                Colato de Sódio                                    0,2                 

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética na Universidade Hokuriku. Ratos Wistar machos (5 semanas) foram alojados individualmente em gaiolas com fundo de fios de aço inoxidável em uma sala com ar condicionado, e tiveram livre acesso permitido a comida e água por 3 semanas. A ingestão de alimentos e o peso corporal de cada rato foi medido diariamente. Todos os ratos foram alimentados com a dieta HCH por 1 semana, seguida por cada uma das várias dietas. Amostras de sangue dos ratos foram coletadas da veia caudal lateral superficial depois de 1, 2 e 3 semanas. O sangue foi coagulado em temperatura ambiente, após o qual foi centrifugado em uma ultracentrífuga (Kokusan H-1300, Japão), a 3000 rpm por 10 min. O soro foi separado e os níveis de colesterol total e triaciglicerol foram medidos usando um método enzimático e um kit comercial, respectivamente. Se necessário, os dados foram comparados usando o teste t de Student bicaudal, e as diferenças foram consideradas significantes quando P < 0,05.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa da Universidade Hokuriku (2008).
Referências
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Sample Availability: Contact the authors.
© 2009 by the authors; licensee Molecular Diversity Preservation International, Basel, Switzerland. This article is an open-access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

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